Desarrollo de un sistema anidado para la detección del virus de la necrosis hipodérmica y hematopoyética infecciosa (IHHNV)

Abstract

El presente trabajo se planteó con el fin de implementar un sistema anidado de PCR, para la detección del virus de la Necrosis Hipodérmica y Hematopoyética Nerviosa (IHHNV). Se emplearon camarones procedentes de una maduración ubicada en la zona de Ayangue, de los cuales se extrajeron muestras de tejido muscular para realizar la extracción de ADN y subsecuentemente desarrollar un protocolo eficaz para la detección de IHHNV. La especifidad del sistema desarrollado, se debe a sus 2 pares de iniciadores, diseñados a partir del genoma del virus. Las secuencias de los iniciadores externos son: forward 5'-CGACTGGCAACAGATCTTCA-3' (E3) y el reverso 5'-AAGTGACGGCGGACAATATC-3´ (E4); y las secuencias de los iniciadores internos son: forward 5´-GAAGTACGACTCCCACCACA-3´(N3) Y para el reverso 5´-CTGACGATAGGGATITTAGTC-3´ (N4). Se determinó la temperatura de hibridación para la primera (59°C) y segunda reacción de PCR (62°C), así como también, el número de ciclos empleados en ambas reacciones (30 y 35 ciclos respectivamente). En base a experimentaciones, se determinó que el sistema anidado pudo detectar una carga viral 10 veces más diluida que el sistema simple de PCR, desarrollado por Robalino (com. per.). Además, se demostró la efectividad del sistema, al ser desafiado por hibridación Dot-blot. De esta manera, el sistema desarrollado en el presente trabajo es útil para la detección de IHHNV.